主要蚊媒及流感病毒甄别检测基因芯片的研制

【摘要】背景蚊媒病毒是一类通过蚊类传播给恒温脊椎动物的病毒。全球范围内影响最大的几种蚊媒病毒包括：登革热病毒、日本脑炎病毒、黄热病病毒、西尼罗河病毒、基孔贡亚热病毒等。多种蚊媒病毒已被列为生物战剂而进行防控。除了传播病毒外，蚊类携带和传播的疟原虫和淋巴系统丝虫也是目前全球范围内最为重要的寄生虫疾病。由于广泛的流行和危害，疟疾和淋巴系统丝虫病被列为全球最优先控制和消除的疾病。蚊媒病原体这种具有从其存在地区突然传播入新地区的能力使得持续监测具有重要的意义。在我国，蚊媒病原体是高温、草地、丛林等战区尤其是边境地区重要的传染病病原体，其引起的多种传染病严重影响部队作战能力和人民日常生活。“诊”、“防”、“治”三个关键环节构成了完整的疾病预防控制链，其中“诊”不仅是疾控链中不可缺少的关键一环，而且也是有效防治的前提。流感病毒分为A、B、C三种型别。目前，临床上有两类广泛使用的抗流感药物，分别是神经氨酸酶抑制剂和基质蛋白2离子通道拮抗剂。随着抗流感药物的广泛使用，这些药物均出现了不同程度的耐药。流感病毒耐药性监测对制定恰当的治疗和预防方案、规范抗流感药物的使用等方面具有重要的意义。2013年中国突然出现的H7N9禽流感给人们带来极大恐慌，截止2014年第2周实验室确证的感染人数达210人，死亡率达22%。很多研究表明在出现流感症状的48h以内使用神经氨酸酶抑制剂比超过48h更加有效。因此，快速和准确的区分H7N9禽流感亚型病毒和其它常见的流感病毒对于临床治疗和流行病学研究具有重要意义。针对上述原因，本文旨在研发三种基因芯片试剂盒用于检测主要的蚊媒病毒和寄生虫、常见的甲型流感病毒奥司他韦和金刚烷胺耐药、新发H7N9禽流感及常见的A型和B型流感。为主要的蚊媒病原体、流感病毒的耐药和分型检测提供新的技术手段，提高军队在热带、丛林战区应对此类生物战剂和高发疾病的应急检测能力。方法以实验室基因芯片试剂盒开发平台为技术手段，研究的技术路线主要分为三部分：1.引物探针筛选。通过文献调研确定靶病原体和靶基因，设计和文献检索用于芯片的引物和探针。收集标准病毒株样本建立质粒参考品，无样本的病原体人工合成制备靶基因质粒。制备灵敏度参考品和特异性参考品，完成引物和探针初步筛选。2.实验条件的优化。重点优化多重RT-PCR和多重PCR扩增体系及芯片检测方法。3.试剂盒性能评价。以阳性参考品、阴性参考品评价试剂盒的特异性。以灵敏度参考品评价试剂盒的灵敏度或采用与其他检测方法比较的方法评价试剂盒灵敏度。检测实际临床样本或病毒样本评价试剂盒的使用效果。结果1.主要蚊媒病毒和寄生虫甄别检测基因芯片的研制：首先，根据文献调研确定了检测的12种常见蚊媒病毒(登革热病毒1-4型、日本脑炎病毒、黄热病病毒、圣路易士脑炎病毒、西尼罗河病毒、东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、基孔肯亚病毒)和7种常见蚊媒寄生虫(间日疟原虫、三日疟原虫、恶性疟原虫、卵形疟原虫、班氏丝虫、马来丝虫、帝汶丝虫)。构建完成了12种病毒和7种寄生虫的质粒参考品。以病毒质粒参考品为模板，制备了10种病毒的体外转录RNA作为灵敏度参考品。构建了MS2噬菌体蛋白包裹的病毒样颗粒作为病毒芯片的RNA阳性参考品。其次，对芯片的引物探针进行了筛选。筛选出19条引物和21条芯片探针用于扩增和检测蚊媒病毒和寄生虫。然后，对芯片的反应体系进行了优化，将蚊媒病毒芯片分为两组多重RT-PCR扩增体系，寄生虫为一组多重PCR扩增体系，优化了引物配比以保证各个靶基因都能够良好的扩增。建立并优化了芯片化学发光检测方法。最后，对芯片的性能进行了评价。特异性评价结果表明芯片可以良好区分上述12种病毒和6种寄生虫(马来丝虫和帝汶丝虫之间无法分型)。灵敏度评价结果表明，病毒芯片的检测限为102-103copies/反应；寄生虫芯片的检测限为101-103copies/反应。中国疾病预防控制中心提供的JEV病毒样本检测结果表明，JEV病毒样本的检测限为100.8-101.8PFU/ml。2.主要甲型流感病毒耐药分析可视化基因芯片的研制：建立了一种同时检测甲型H1N1、季节性H1N1、H3N2三种常见流感亚型奥司他韦耐药相关的NA基因H275Y(N1型流感)和E119V(N2型流感)突变，金刚烷胺耐药相关的M2基因V27A和S31N突变的高通量方法。首先，构建了野生型和耐药型质粒，以质粒为模板制备了野生型和耐药型体外转录RNA。其次，筛选出检测金刚烷胺耐药的2对引物和23条芯片探针，与文献中检测奥司他韦耐药的引物和探针组合成完整的芯片体系。第三，优化了两组多重RT-PCR体系和量子点催化银沉积的可视化检测方法。第四，对芯片的性能进行了评价。阳性病毒样本和阴性病毒参考品检测验证了芯片流感分型特异性，野生和耐药的体外转录RNA验证了芯片耐药检测的特异性。灵敏度评价结果表明芯片的灵敏度与流感病毒荧光定量RT-PCR试剂盒灵敏度相当。对PH1N1野生和耐药混合模板检测结果表明，当低拷贝模板达到1%-5%时芯片即可检出。最后，检测了307例临床咽拭子样本。其中的全部281例阳性样本均携带金刚烷胺耐药突变(S31N)，全部5例季节性H1N1同时携带奥司他韦耐药突变(H275Y)，H3N2和甲型H1N1未发现奥司他韦耐药突变。芯片与测序结果的符合率达到98.8%。3.新发H7N9禽流感病毒甄别检测基因芯片的研制：用于分型检测H7N9禽流感、H5N1禽流感、甲型H1N1、季节性H1N1、季节性H3N2五种A型流感，并能够通用的检测A型和B型流感。首先，设计并筛选了H7N9禽流感HA和NA基因2对引物和3条探针以及1组人RNaseP内标引物探针。其次，将筛选出的H7N9引物探针与文献中其他亚型引物探针进行组合。优化了三组多重RT-PCR体系，建立并优化了化学发光检测方法。第三，40例流感病毒培养样本检测结果证明了芯片对于上述流感亚型分型性能良好，灵敏度评价结果表明，芯片的灵敏度与流感荧光定量RT-PCR试剂的灵敏度相当或低10倍。最后，应用芯片检测了66例临床样本验证了芯片的实用性。结论研发了三种分别用于检测常见的蚊媒病毒和寄生虫、常见的甲型流感病毒奥司他韦和金刚烷胺耐药、新发H7N9禽流感及常见的A型和B型流感基因芯片试剂盒。特异性和灵敏度评价结果表明三种基因芯片试剂盒均达到预期的性能要求。为常见的的蚊媒病毒和寄生虫、常见的流感病毒耐药检测和分型检测提供了新的检测手段，提高了军队在热带、丛林站区应对此类生物战剂和高发疾病的应急检测能力。
【作者】张英杰；
【导师】王升启；
【作者基本信息】中国人民解放军军事医学科学院，药物分析学，2014，博士
【关键词】蚊媒病毒检测；蚊媒寄生虫检测；流感耐药检测；流感分型；基因芯片；

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